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ELISA 常见问题解决方案汇总

作者:丁香园 发布时间:2014-10-20

ELISA 实验因其灵敏度较高、特异性较好而广泛应用于临床上,但操作中的各环节对检测效果影响较大,稍不注意,就有可能导致显色不全、花板。

问题主要集中在这几个方面:选材、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。问题及解决方案具体解析如下:

选材

选择质量优良的检测试剂(可以看下 ELISA 试剂盒选购经验总结篇),操作前将试剂在室温下平衡 30-60 分钟。

加样

出现问题可能原因
1. 
血清或血浆标本分离不好即进行加样。
2. 
手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)。
3. 
加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

解决方案
1. 
标本为血清:最好将血液先自然存放 1-2 小时后,再用 3000 rmp 离心 15 分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次,放置一段时间后,3000 rpm 离心 15 分钟;若在几天内检测,可放在 2-8℃冰箱中,若要贮存,则置于 -20℃的低温冰箱内。
2. 
加样后及时放入孵箱。
3. 
加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4. 
如果采用 AT 或其他全自动加样,最好选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。
5. 
标本较多时,请分批操作。

孵育

出现问题可能原因
1. 
孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于清洗彻底。
2. 
孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。

解决方案
1. 
贴封片或加盖;
2. 
按说明步骤严格控制操作时间。

洗板

出现问题可能原因
1. 
采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2. 
采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差。
3. 
反应板过多造成洗板等待时间长。

解决方案
1. 
保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干。
2. 
合理安排,或多用几台洗板机。

显色

出现问题可能原因
1. 
显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂。
2. 
加显色剂时溅出孔外造成液体回流。

解决方案
1. 
显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用。
2. 
加样时保持显色剂不外流。
3. A
液应避免接触金属器械。

终止

出现问题可能原因
加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加。

解决方案
加终止液时应避免产生气泡。

读板

出现问题可能原因
读板时板底不清洁。

解决方案
应保证酶标板清洁。

全过程

1. 
整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。
2. 
实现 ELISA 检测标准自动化,有效提高检测质量。

 文章来源:丁香园

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