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WB实验,有人能随随便便成功吗?

作者:丁香园中级站友 Irb2001 发布时间:2014-09-19

做了很久的WBwestern blot),走了很多弯路,其实发现WB想要做好并不难,总结了WB实验中可能会遇到的问题,分析了可能的原因及对应的解决方案,希望能成为你实验成功的基石。

问题1:转膜不充分

(1)
膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)
靶蛋白分子量小于10 000
选择小孔径的膜,缩短转移时间。
(3)
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。
(4)
甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。
(5)
转移时间不够
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

问题2:背景高

(1)
膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)
洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数。
(3)
阻断不充分
增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)。
(3)
二抗浓度过高
降低二抗浓度。
(4)
检测过程中膜干燥
保证充分的反应液,避免出现干膜现象。
(5)
曝光过度
缩短曝光时间。
(6)
抗体与阻断蛋白有交叉反应
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。
 
问题3:没有阳性条带

1)抗体染色不充分
增加抗体浓度,延长孵育时间。
2)酶失活
直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
3)标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
4)试剂不匹配
一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。
5)一抗失效
选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液。
6HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
 
问题4:有阳性条带,但条带比较弱

1)抗体染色不充分
增加抗体浓度,延长孵育时间。
2)酶活性降低
直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
3)标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
4)洗膜过度
缩短洗涤时间。
5HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
6)抗体活性降低
选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置。
7)封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型。
8)曝光时间过短
延长曝光时间。
9HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
 
问题5:条带位置(大小)不对;或有非特异性条带

1)二抗的非特异性结合
增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)。
2)一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性。
3)蛋白降解
使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂。
4)二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度。
5)抗体浓度过高
降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带。
6)蛋白上样量过大
降低上样量。
 
问题6:背景有斑点

1)封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂。
2HRP耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂,去除聚集体。
 
问题7:膜上出现反像(暗背景上白色带)

1HRP含量过高
降低酶联二抗的浓度。

其他

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