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厦门施科生物科技有限公司
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蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)操作流程!

作者:施科 发布时间:2014-08-02

1 蛋白样品提取制备

2 蛋白定量 

3 电泳

(1)制胶,分别制备分离胶和浓缩胶。根据不同分子量的蛋白选择不同浓度的分离胶:

蛋白分子量(kDa)

凝胶浓度(%)

4-40

20

12-45

15

10-70

12

30-100

10

50-200

8

(2)选择相应的预染蛋白Marker,以助于分辨蛋白的大小和电泳示踪。 

 

4 电泳 

(1)点样:每孔上样量为20-40 μg蛋白,点样时注意样品不要溢入相邻上样孔。

(2)电泳条件:应根据电泳仪说明书推荐方法进行电泳。

5 转膜与蛋白显色检测

(1)根据胶的尺寸准备相同大小的滤纸6张和膜1张(一定要戴手套)。PVDF膜须置于甲醇中1~2 min,去离子水清洗几次,并用转移液平衡后待用。NC膜可用转膜缓冲液润湿后直接使用。

(2)在加有转膜液的托盘里放入转膜用的夹子、海绵垫、玻棒或塑料板、滤纸和浸过的膜。

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,排除里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸,排除气泡。

(4)分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,除去气泡。将膜盖于胶上,在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,除气泡后合起夹子。

(5)将夹子放入转移槽槽中,夹的黑面对槽的黑面,白面对槽的红面。根据蛋白分子量决定转膜条件。 

6 免疫反应

6-1 膜的封闭

为防止一抗及(或)二抗于膜产生非特异性结合,转膜后需要对膜进行封闭。一般采用脱脂奶粉或者BSA封闭液。但对于磷酸化蛋白,不能使用脱脂奶粉作为封闭液。有些抗体用BSA封闭时,产生的信号比脱脂奶粉强,目前原因不明。

封闭时,4 ℃摇床上摇动封闭过夜,或37 ℃封闭2小时。封闭结束后TBS洗膜5-10秒,进行抗体孵育。

6-2 孵育一抗/二抗

(1)根据抗体说明书建议的稀释倍数,用TBST稀释一抗。

(2)将膜装入自封袋并用压膜机固定,抗体溶液加入到自封袋中,确保抗体的体积足够孵育膜;37 ℃摇晃孵育1 ~ 3 h (具体时间根据抗体效价和浓度而定),或者4 ℃孵育过夜,用TBST在室温下摇床上洗2次,每次5 ~ 10 min,再用TBS洗一次,5 min。 

(3)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触洗涤后,进行化学发光反应。其中二抗根据说明书建议的稀释倍数稀释,室温摇晃孵育1 h。

7 化学发光、显影、定影

(1)在暗室中,将显影液和定影液分别到入塑料盘中;将A和B两种试剂在离心管里等体积混合;将膜蛋白面与此混合液充分接触;1~2 min后,将膜去尽残液。 

(2)在红灯下取出胶片,用切纸刀剪裁适当大小;打开胶片夹,把胶片放在膜上,关上胶片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间;曝光完成后,取出胶片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。显影结束后,立刻把胶片浸入定影液中,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。拍照。