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Real-time qPCR 常见问题分析 |
| 作者：厦门施科生物 发布时间：2014-08-01 |
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1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因？ 建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。 2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右？ 扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。 3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线？什么原因？ 模板浓度过低或者模板降解。 4. ROX 校正为何可以导致熔解峰的不专一？ ROX也是一种荧光染料，会有荧光的发生。 5. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少， Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用？ 可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。 6. 引物浓度可否是50nM，是否太低？ 如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。 一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。 7. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决？ Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。 8. miRNA反转录引物和定量方法？与mRNA发转录及real-time PCR有和区别？ 一般常用的反转录primer有2种，一种是step-loop的primer；一种是首先3末端加A，然后ployT再发转录。 用于real-time qPCR的上游primer都是针对miRNA结构本身的；下游有个通用primer。定量可以用SYBR Green I，也可以用Taqman。 9. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好？ 相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别；如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。 10. 熔解程序可否不加？ 如果是扩增效果好，特异扩增，可以不加熔解程序；但建议做好加上。 11. 扩增反应体系5μL，扩增效率低，什么原因？ 反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。 12. 如何减少非特异性扩增的干扰？ 设计一对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温度。 北京百泰克生物技术有限公司 |