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Real-time qPCR 常见问题分析

作者:厦门施科生物 发布时间:2014-08-01
1. 做标准曲线时候,可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?
建议最好用同样稀释倍数做曲线,因为模板浓度会影响扩增效率。
2. 熔解曲线中,Tm不出现在80度左右?
扩增片段100bp左右的,一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现,可能是模板降解。
3. 扩增曲线没有Ct值,仅仅一条斜线?什么原因?
模板浓度过低或者模板降解。
4. ROX 校正为何可以导致熔解峰的不专一?
ROX也是一种荧光染料,会有荧光的发生。
5. 如果内参和目标基因表达量差别比较大,也就是目的基因的表达量少,
Ctcon=15,Cttarget=38,可否应用?
可以用于数据分析。因为表达量低,从而用过高模板进行扩增,从而同内标的模板不同,反而会增大数据统计的误差。
6. 引物浓度可否是50nM,是否太低?
如果扩增曲线和熔解曲线比较好,这个浓度当然可以。如果更低,扩增结果好的情况下,同样可以运用。
一句话,所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的,会影响扩增效率。
7. miRNA多个扩增时候,如果一个的扩增效果比较,其它熔解曲线不止一个峰,如何解决?
Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。
8. miRNA反转录引物和定量方法?与mRNA发转录及real-time PCR有和区别?
一般常用的反转录primer有2种,一种是step-loop的primer;一种是首先3末端加A,然后ployT再发转录。
用于real-time qPCR的上游primer都是针对miRNA结构本身的;下游有个通用primer。定量可以用SYBR Green I,也可以用Taqman。
9. 相对定量方法,如果用Ct值比较,是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?
相对定量的方法各有优缺点,主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大,这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大,建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线,分别带入Ct值计算。
10. 熔解程序可否不加?
如果是扩增效果好,特异扩增,可以不加熔解程序;但建议做好加上。
11. 扩增反应体系5μL,扩增效率低,什么原因?
反应体系小,各种因素的影响比较大,比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。
12. 如何减少非特异性扩增的干扰?
设计一对好引物,提高primer的退火温度,以及设定吸光温度。

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